===Cours de Microbiologie===

Physiologie bactérienne
Le métabolisme bactérien




1- Métabolisme Energitique:
Les B. chimioheterotrophes, B. d’intérêt médical produisent leur énergie grâce au métabolisme d’un substrat organique.
Cette énergie produite sous forme d’ATP se fait par 2voies:
-La fermentation dans la quelle les composants organiques servent aussi bien de donneurs que d’accepteurs d’é.
-La respiration dans laquellel’02 ou d’autres composes oxygénés inorganiques agissent comme accepteur terminal d’é.

A I- fermentation
Elle se définit comme un ensemble de réactions biochimiques anaérobies d’oxydation et de réduction procurant à la B. l’énergie nécessaire à ses biosynthèses grâce à des phosphorisations au niveau du substrat ayant lieu uniquement dans le cytoplasme.
- le glucose est le substrat le plus étudié.
- sa dégradation conduit à la formation de produits qui servent de base à la biosynthèse.
- la dégradation du glucose conduit à:
• formation des acides organiques.
• Production de gaz
• formation de métabolites de dégradation.

* Formation d’Acides organiques:
- La fermentation bactérienne des glucides s’accompagne de la synthèse d’acides organiques (acidification du milieu qui faite virer l’indicateur coloré).
- Les sucres étudiés sont assez divers, ils seront ajoutes sous forme de solution de 0,5 à I % directement au milieu liquide ou au milieu solide après fusion à 50 C°.
3 Sortes de milieux sont utilisés au labo.
a- Milieu glucidique liquide simple:

Ex: milieu nutritif liquide sucre à étudier ind PH

b- Milieu glucidique gélosé simple:

Ex : milieu mannitol mobilité = gélose molle contenant du mannitol rouge de phénol nitrates.
- Il se présente en culot.
- Il est ensemence par piqûre centrale unique.
- Permet d’apprécier en plus de l’utilisation du mannitol la mobilité du germe.
Interprétation:
- Milieu gélose rouge ---------------------> Mannitol -
- Milieu gélose jaune ---------------------> Mannitol
-Culture le long de la piqûre centrale------> mobilité -
-Culture ou trouble dans toute la masse----> mobilité
- les nitrates sont ajoutés pour éliminer les gaz formes qui pourraient fausser la recherche de la mobilité.
- ce milieu permet également la recherche de la N.R par la technique de GRIESS- ILOSWAY.

c- Milieu glucidiques gélosés complexes:

ex : KIA = KLiglker agar: glucose-Lactose
TSI = Triple sugar iron : Glucose —Lactose- Saccharose.
Ces 2milieux se présentent en gélose inclinée contenant:
- du glucose à l% g
- du lactose / saccharose 10% g
- du rouge de phénol.
- sulfate ferreux
- thiosulfate de Na
- peptones.

Le milieu est rouge au départ.
Ces milieux sont ensemences sur la pente puis par piqûre centrale au niveau du culot.

Interprétation:

- Dans un premier temps, la fermentation du glucose conduit à une acidification qui fait virer le culot au Jaune.
-Dans un 2eme temps la B dégrade les peptones et les 2 autres Sucres.
-la dégradation des peptones en AA Alcalinisation du milieu
- La dégradation des sucres Acidification du milieu
Culot: * Rouge -------> Glu -
* Jaune -------> Glu
Pente : * Rouge ------> Lac sac -
* Jaune --------->Lac sac

* Production de gaz:
La fermentation s’accompagne de la production de H2, C02 ou les 2 à la fois.
H2 : lors des réactions d’oxydation des substrats
C02: lors de la dégradation des sucresC6-----(co2->)-->C5--(co2->)--> C4--(co2->)--> C3


Ces gaz se recherchent sur:
• Milieux liquides dans lesquels est immergé un petit tube renversé appelé « Cloche de DURHAM » qui emprisonne le gaz formé sous forme de bulles d’air.

• Milieux solides ex KIA ou TSI; la production de gaz est visualisée par le décollement de la gélose formant une poche d’air.

* Formation des métabolites de dégradation:
Au cours de la fermentation du glucose , il y a formation:
• de divers produits terminaux acides : Ac formique , Ac acetique, Ac butyrique , Ac propénoïque….
• ou d’Alcools : méthanol — butane diol.
Ces produits sont recherches en pratique courants à partir du milieu Clarck et lubs
2 propriétés fermentaires vont être testes:
- la 1ere vise à mettre en évidence la présence des acides organiques = C’est la réaction du Rouge de méthyle = R.M
la 2ème cherche une étape intermédiaire de la transformation de l’acide pyruvique qui consiste en la production d’acetoine : c’est la réaction de VOGES-PRAUSKAUER = VP


[size=14]-Test du RM:
-consiste à ajouter au milieu clark et Lubs inoculé depuis 24h , 2 à 3 gouttes de solution alcoolique de rouge de methyl à 0,2%
Si
-coloration jaune réaction-= - RM-
-coloration Rouge réaction = RM
-Test de VP:
- dans un tube contant le milieu clark et Lubs inoculé depuis 24h ajouter:
0.5m1 de solution a Naphtol et 0.5ml de KOH à 16%
- agiter et laisser le tube en position inclinée pendant 10 mn.
Si :
-Aucune coloration Réaction - = VP-
-Coloration rose — Réaction = VP
Remarque : les Bactéries VP sont normalement RM-
Il existe des exceptions :Listeria monocytogenes

B / -Respiration
La fermentation est un processus de production d’énergie relativement inefficace car le glucose n’est jamais complètement oxydé.
Dans la respiration un substrat pluri carboné est successivement oxydé jusqu’au stade monocarboné C02 H2 donc l’énergie produite est plus importante que celle produite au cours de la fermentation.

-La respiration est caractérisée par l’accepteur final d’électrons
* 02 : Respiration aérobie
* substrat oxygène inorganique : Respiration anaérobie
Quelque soie le type respiratoire, la production d’énergie implique 2 processus différents et complémentaires:
• l’un concerne la transformation des composes carboné en C02
• l’autre le transport des électrons

-a- cycle tricarboxylique de Krebs:
-Ce cycle permet l’oxydation complète des composes carbones
-l’intermédiaire principale du métabolismedes hexoses durant la glycolyse est le pyruvate.
Cette étape constitue un tronc commun aux B. aérobies et anaérobies.

-Dans les conditions d’aérobiose le pyruvate est converti en acétyle COA qui est le substrat du cycle de krebs.
Ce cycle est absent chez les B dont le métabolisme est purement fermentaire Ex: Clostridium
-un test permet de déceler la présence de ce cycle chez une B.
-C’est la recherche de l’utilisation du citrate comme seule source de carbone
-Seules les B douées d’un pouvoir respiratoire peuvent oxyder le citrate par
l’intermédiaires du cycle de Krebs.

Au laboratoire on dispose de 2 milieux:
• Milieu de simmons = milieu synthétique
• Milieu de christensen = milieu synthétique glucose.

* le Milieu de simmons est un milieu synthétique contenant du citrate et du bleu de bromothymol.
- il se pressente en tube sous forme de gélose inclinée.
- l’ensemencement se fait par strie sur la partie inférieur du tube ( 2/3) , la partie supérieure servira de témoin et ce à partir d’une culture provenant toujours d’un milieu gélosé.
-Après incubation: la dégradation du citrate se traduit par un virage du milieu duvert au bleu.
Vert Bleu = réaction ----> Métabolisme Respiratoire
Vert Vert = réaction - ----> Métabolisme fermentaire (MB)ou bactérie ne possèdent pas de perméase nécessaire pour la pénétration du citrate.
*Milieu de christensen : est un milieu semi synthétique qui contient en plus du citrate , du glucose en faible concentration et un indicateur de PH = le Rouge de phénol.
La faible quantité de glucose servira à la synthèse de la perméase nécessaire à la penetration du citrate dans la B.

Interprétation:
-après ensemencement en strie:
• Colonies roses = réaction = C. christensen
• Pas de colonies roses = réaction - = C. christensen- ----> MB fermentaire

b)- Voies d’attaque des glucides:
Les bactéries chimioheterotrophes produisent leur énergie à partie d’un substrat organique qu’elle dégrade selon 2 voies métaboliques:
Fermentation ou Respiration

Au laboratoire, l’épreuve de HUGH -LEIFSON permet de déterminer la voie empruntée en utilisant des géloses moles =
Milieu M.E.V.A.G. gloses semi solides glucose Rouge du phénol
se présentant en tube devant être régénérés avant emploi.
• L’ensemencement se fait par pique centrale.
• Pour l’étude d’une souche bactérienne, on utilisera 2 tubes:
- l’un sera recouvert de vaseline tube fermé.
- l’autre non recouvert = tube ouvert.
Après incubation:
- 2 tubes jaune---------------> MB fermentaire
- Tube ouvert seul jaune ----------->MB oxydatif/ Respiratoire.
- 2 tubes rouge (pas de virage ) --------------->B inactive vis-à-vis du sucre.

c) Transport d’ ê:
Chez les Bactéries le transport des électrons est réalisé au niveau de la membrane cellulaire ou siégent les composant de transport.
Les composants majeurs d’une chaîne de transport d’ sont:
• des flavoproteines (FAD , NADH...)
• des quinones (ubiquinones, menaquinone…)
• des cytochromes (Cyt c, cytochrome oxydase aa3
- Ces cytochromes sont identifiés au labo par le test de l’oxydase.
- Ce test révèle la présence des cytochromes C et aa3 de la chaîne respiratoire aérobie.

Principe: les cytochromes C et aa3 oxydent le dimthyl para phenylene diamine en une semi quinone colorée en rouge violacée.
En pratique la recherche de l’oxydase se fait par la technique de Kovacs:
• on prélève une ance de culture et on la dépose sur un papier buvard imprégné de réactif:
Si:
• coloration rouge violacée = R = Oxydase
• Pas de coloration = R - = Oxydase -

Remarques:
- travailler uniquement avec une anse de platine.
-Ne pas travailler avec des souches provenant de milieux acides ex KIA ou TSI , l’acidité crée suite à la fermentation des sucres inhibe la synthèse des cytochromes (Réactions faussement-)

BI -Respiration aérobie:

Elle correspond à une série de transfert d’é jusqu’à un accepteur final d’é qui est l’02 moléculaire et à une synthèse concomitante d’ATP
• au cours de cette respiration , il se produit des réactions non cytoromiques qui aboutissent à la formation de H202 toxique pour la bactérie.
• Cette B synthétise une enzyme de détoxification = catalase
H2O2 ----catalase-----------> H2O ½ O2

L’02 libère est mis en évidence par contact d’une colorie bactérienne avec une goutte d’ H202 à 10V.
Si:
o formation de bulles d’air == R = catalase
o Pas de bulles d’air == R- = catalase-
Remarque: ne pas rechercher cette enzyme sur milieu contenant du sang frais

B2 — Respiration anaérobie:

- la production d’énergie par un métabolisme oxydatif peut aussi avoir lieu en anaérobiose.
- Les voies de dégradation du carbone sont identiques à la respiration aérobie et le transfert d’é se fait à l’aide d’une chaîne respiratoire similaire à celle des aérobies.
- l’accepteur final d’é n’est plus l’02 mais un composé inorganique oxygène
ex : NO3 (nitrate) NO2 (nitrate).
- la réduction des nitrates, en nitrates se fait grâce à une enzyme la Nitrate Réductase = N R.
- la présence de cette enzyme est un caractère de classification recherché couramment au labo.

Au labo la NR est mise en évidence par ensemencement d’un bouillon nitrate contenant du nitrate de K à 1%.
Après incubation, la lecture se fait après addition des réactifs de Griess- Ilosway
NRI= AC sulfanilique : 10 gouttes
NRII = a Naphtylamine : 10 gouttes
Il s’agit d’une réaction de diazotation
Si:
• Apparition d’une coloration rouge = R = NR
• Pas de coloration rouge: B dénitrifiante NO3---> N2
ou Absence de NR.
Ajouter à la préparation de la poudre de zinc et après un léger chauffage:
Si..
</I>coloration rouge: R - = NR -
- pas de coloration : R = NR

II- Métabolisme Glucidique:
Il se confond avec l’étude du MB énergétique.
Les tests déjà cités permettent d’explorer ces 2 MB qui seront complètes par l’étude des enzymes intervenant dans la dégradation des polyosides.

1- Recherche de la b-galactosidase:
Cette enzyme hydrolyse le lactose en glucose et galactose.
elle pressente 2 caractéristiques.

• elle est intracellulaire: ne peut agir sur le lactose que si celui-ci pénètre à l’intérieur de la cellule bactérienne.
• elle est inductible: elle est synthétisée uniquement si la culture bactérienne est faite en présence de lactose.

En pratique , on recherche la b-Galactosidase à partir des B récoltées sur milieux gélosés lactoses.
Les colorie sont mises en suspension dans de l’H20 distillée stérile disque d’ONPG = orthonitrophénol b-Galactoside (b-galactose substitué).
Après incubation à 37° :
-coloration jaune = R = ONPG
- pas de coloration : R- = ONPG-

2) Utilisation de l’Esculine:
L’esculine est hydrolysée en esculine glucose.
L’esculetine se combine avec les sels de fer donnant une réaction colorée en noir
Cette réaction peut se faire sur 2 milieux:

- Milieu à l’esculine : milieu gélose ensemence par piqûre centrale R = noircissement du milieu
-Milieu bile-esculine : permet de rechercher 2caractères:

- Hydrolyse de l’esculine : R = noircissement du milieu
- Culture en milieu hostile (présence de labile)

III — Métabolisme Protidique:

L’Hydrolyse enzymatique des protéines aboutit à la libération d’AA dont le catabolisme fait appel à certaines enzymes spécifiques.

1-Recherche de la gélatinase.

Se fait par la méthode de la pellicule photographique:
-Dans un tube, réaliser à partir d’une culture jeune, une suspension dense du germe en H20 distillée stérile et ajouter: 1 goutte Je toluène et 1 languette de pellicule photographique.
Incuber à37° pendant quelques heures:
L’action de la gélatinasse se traduit par la mise a nu de la partie immergée de la languette de pellicule qui devient transparente.

2-Recherche des desulfhydrases:

-Ces enzymes agissent sur les AA soufres ex cysteine …….en produisant del’hydrogène sulfure H2S.
-La présence de ces enzymes est mise en évidence au labo sur milieu T.S.I. (contient entre autre du sulfate ferreux.).
- I’hydrogène sulfure en présence de sels métalliques (sulfate ferreux) donne naissance à un sulfure métallique insoluble le F2S (sulfure de fer) qui se traduit par un noircissement du milieu.
FeSO4 H2S -----> FeS (precipité noir) ............

3-Recherche de :
- lysine décarboxylase LDC
- Ornithine décarboxylase ODC
- Arginine dyhidrolase ADII

Arginine----ADH-----> Agmatine
Lysine----- LDC----> Putrescine
Ornithine----- ODC-----> cadavérine

-ces enzymes sont mise en évidence sur milieu liquide Moeller-Falkow
-Ce milieu contient des peptones glucose pourpre de bromocrésol AA à étudier.

Pour l’étude d’une seule souche bactérienne 4 tubes seront nécessaires:
T- ADH-LDC- ODC.

-Les milieux sont ensemencés avec une suspension bactérienne dense puis seront recouverts d’huile de vaseline stérile.
Après incubation:
- T: obligatoirement jaune
- ADH-LDC-ODC=jaune.=R --
- ADH — LDC — ODC = violet = R (Alcalinisation du milieu qui fait virer l’indicateur de PH du jaune au violet).

4- Recherche de la : Urease-Tryptophanase- Tryptophane désaminase (T.D.A):

La mise en évidence de ce citernes 3 enzymes se fait sur un seul et même milieu appelle: Milieu de Ferguson = milieu urée-indole.
-C’est un milieu liquide contant de l’urée tryptophane rouge de phénol.

-la présence de ces trois enzymes est mise en évidence par la détection de leurs métabolites

*Uréase:
Urée-------uréase--------> C02 NH3 (alcalinisation).
Si
• Virage du milieu au rouge violacé = R = Uréase
• Pas de virage =R- = Uréase -

*Tryptophanase:
Tryptophane----Tase--------> indole.
L’indole est extrait en phase alcoolique par addition du réactif de Kovacs= dimethyl para amino benzaldehyde, dans de l’alcool amylique.
Après agitation:

si
• Anneau rouge == R = Tryptophanase
• Anneau jaune == R- = Tryptophanase-
Cette enzyme peut être recherchée sur milieu peptoné exempt d’indole.


= Tryptophane des aminose TUA
Tryptophane----TDA-------> acide indole pyrique
Ce métabolite réagit avec les perchlorure de fer = réactif TUA en donnant un précipité noir = TUA .IV- Métabolisme lipidique:

1- Recherche des lipases:
Les lipases sont des enzymes qui hydrolysent les esters d’Acides gras à longue chaîne carbonée ex = Tween = ester de sorbitol et d’ac gras.
-La recherche de la lipase se fait par la technique de SEIRRA.
-On incorpore dans une gélose ordinaire 1% de tween 80 CaCl2
-On coule en boite de pétri et on ensemence en touches.
[size=14]Après incubation:
R = Formation d’un halo opaque autour des colonies , lié à la précipitation des Ac gras sous forme de sels de calcium.

2-Recherche de lécethinase:
-Cette enzyme hydrolyse le lécithine.
-Elle est détectée par une technique qui consiste à enrichir une glose ordinaire par l’incorporation d’un jaune d’ oeuf.
-Ensemencer par touches.
Après incubation:
R opacification autour des colonies

Etude cytobactériologique des urines (ECBU)




I) Définition- Fréquence:

° L'ECBU= l'examen cytobactériologique des urines permettant d'affirmer le diagnostic d'infection urinaire est l'analyse bactériologique le plus couramment pratiquée en laboratoire d'analyse médicale.

° L'infection urinaire représente li deuxième motif de consultation médicale après les infections respiratoire (nécessité d'une ATBiotherapie).

° Prés de 80% des infections urinaires surviennent chez les femmes.

Environ 20% de la population féminine présentera au moins l'épisode infectieux au cours de sa vie , un premier pic de fréquence se situe entre 20 et40 ans , l'autre après 60ans.

°L'infection urinaire= est un terme général qui fait référence a la présence de germe dans les urines (sans présager[1] du site précis de l'infection).

Les bactéries qui colonisent les cavités excrétrices et le parenchyme rénal provoquent une réaction inflammatoire.

°Ces bactéries et les cellules de l'inflammation retrouvées dans l'urine sont les témoins de l'infection.

II) Recueil des urines (Prélèvement):

° Etape essentielle, conditionne pour une grande part la qualité de l'examen et l'interprétation des résultats.

° Le recueil et le transport des urines doivent être effectuer dans des conditions rigoureuses afin d'éviter les contaminations d'origine urétrales périnéale ou vaginale.

II-1) Recueil des urines par méthodes classiques:

° ECBU est effectué sur les premières urines du matin où a défaut sur des urines de la journée 4 heures au moins après la miction précédente.

° Le recueil est précédé d'une toilette locale minutieuse au savon ou avec un antiseptique type DAKIN suivi d'un rinçage a l'eau stérile.

° Le recueil s'effectue en une position debout (en écartant les lèvres avec les doigts chez la femme); Le premiers jet d'urine est éliminé , le milieu de miction ( ou 2ème jet) correspondant a l'urine vésicale est recueilli dans un flacon stérile la fin de la miction est éliminée.

° Les urines doivent être acheminées au laboratoire dans les plus brefs délais: max 30min.

A défaut d'un transport immédiat, conservées a 4°c, 2 heures au max.

° Elles seront accompagnées d'une fiche de renseignements correctement remplie:

Nom – Prénom – Age – sexe – mode et heure de prélèvement – signes cliniques – trt.

II-2) Recueil des urines par autres méthodes :

Ce sont des méthodes plus invasives:

* 2- a le sondage vésical:

comporte des risques d'infection iatrogènes et doit être éviter au max.

* 2- b la ponction vésicale sus-pubienne:

présente moins de risque d'infection, c'est un geste spécialisé.

II-3) Recueil des urines chez le NRS:

° Les urines sont recueillies après nettoyage soigneux de la région périnéale dans un sac collecteur en plastique fixé au moyen d'un adhésif.

° Ce sac ne doit pas être laissé plus de 30 min. Au delà de ces 30min, placer un nouveau sac après avoir recommences la toilette.


III) Etude cytobactériologique des urines:

Les urines doivent être analysées sans retard.

° III – 1 Examen macroscopique :

- a peu d'intérêt

- l'urines peut être limpide, claire, trouble, jaunâtre, sanglante peut contenir des filaments…

° III – 2 Examen microscopique :

examen qualitatif: coloration de GRAM

réalisée sur le culot de centrifugation de l'urines.

examen quatitativf: c'est la numération des éléments figurés sur cellules "Nageotte" ou "Malassez".

Le résultats est exprimé en nombre d'hématies ou leucocytes par ml ou mm .

*Les urines normales contiennent moins de 10cellules/mm .

*Toute leucocyturie 10 éléments/ml est considérée comme pathologique (réaction inflammatoire).

° III -3 Examen bactériologique:

a pour but de dénombrer les bactéries.

d'isoler la ou les bactéries en cause.

III-3-a) Dénombrement des germes urinaires (DGU): plusieurs méthodes:

1 méthode originale de Kass:

° faire des dilutions en séries de 10 en10.

° volume connu de chaque dilution est étalé sur une boite de pétri.

2 méthode de Veron:

° l'urine est diluée au 1/100 en eau distillée stérile. (2 gouttes d'urine dans 10ml DS=1/100)

° on étale 0.1ml= 2 gouttes de cette dilution sur une gélose nutritif a l'aide d'un râteau.

° on incube a 37°c pendant 24h.

° lecture ; compter le nombre de colonies ayant poussées sur GN:
DGU= nbr de col 10 100



DGU=nbr de col 1000

Toute bactériurie 10 bactéries/ml est considérée comme pathologique.




3 autres méthodes : Méthodes de anses calibrées.

Méthodes de la lame immergée.

III-3-b) Isolement de la bactérie ou des bactéries en cause:

l'isolement est réalisé sur:

° BCP ou Gélose Mac Coukey: milieu pour BGN.

° GSF: si présomption ou streptocoque ou de bactéries exigeantes.

° Sabouraud+chloramphénicol: si présomption de levure.

III-3-c) Identification biochimique

III-3-d) ATBgramme

III-3-e) interprétation: voir tableau

Résume: le diagnostic biologique d'une infection urinaire est posé en présence de:

- Leucocyturie 10 elt /ml

- Bactériurie 10 elt /ml selon les critères de Kass.

Tenir également compte du contexte clinique.